Spektrofotometri su postali rutinski instrumenti u modernim laboratorijama molekularne biologije. Često se koristi za nukleinske kiseline, kvantifikaciju proteina i kvantifikaciju koncentracija bakterijskog rasta.
Jednostavan princip spektrofotometra
Spektrofotometar koristi izvor svetlosti koji može da generiše višestruke talasne dužine i prolazi kroz seriju spektroskopskih uređaja kako bi generisao izvor svetlosti specifične talasne dužine. Nakon što izvor svjetlosti prođe kroz uzorak koji se testira, dio izvora svjetlosti se apsorbira i izračunava se apsorbancija uzorka, čime se pretvara u koncentraciju uzorka. . Apsorbancija uzorka je proporcionalna koncentraciji uzorka.
Kvantifikacija nukleinskih kiselina
Kvantifikacija nukleinskih kiselina je najčešće korištena funkcija spektrofotometra. Oligonukleotidi, jednolančana, dvolančana DNA i RNA mogu se kvantificirati u puferu. Apsorpcioni pik najvišeg apsorpcionog pika nukleinske kiseline je 260 nm. Molekularni sastav svake nukleinske kiseline je različit, tako da su faktori konverzije različiti. Za kvantifikaciju različitih tipova nukleinskih kiselina, odaberite odgovarajuće koeficijente unaprijed. Na primjer, apsorbancija 1 OD odgovara 50 μg / ml dsDNA, 37 μg / ml ssDNA, 40 μg / ml RNK i 30 μg / ml Oliga. Apsorbancija nakon testa se pretvara pomoću gornjih koeficijenata da bi se dobila odgovarajuća koncentracija uzorka. Pre testiranja, izaberite pravilnu proceduru, unesite zapreminu osnovnog rastvora i razblaživača, a zatim testirajte rastvor praznog uzorka i uzorka. Međutim, eksperiment nije uvijek bio glatak. Nestabilna čitanja mogu biti najveća glavobolja za eksperimentatora. Instrumenti sa većom osetljivošću pokazuju veći pomak apsorbancije.
Zapravo, princip dizajna i princip rada spektrofotometra omogućavaju da apsorbancija varira u određenom opsegu, odnosno instrument ima određenu preciznost i preciznost. Na primer, tačnost Eppendorf Biophotometera je ≤1% (1A). Rezultati takvih višestrukih testova variraju između oko 1,0% srednje vrijednosti i normalni su. Osim toga, potrebno je uzeti u obzir i fizičko-kemijska svojstva same nukleinske kiseline i pH pufera u kojem je otopljena nukleinska kiselina, koncentracija iona i sl .: Kada je koncentracija iona previsoka za vrijeme ispitivanja čitanje pomiče, pa se preporučuje da se koristi određena pH vrednost i niska koncentracija jona. Puferi, kao što je TE, značajno stabilizuju očitavanja. Koncentracija razrjeđenja uzorka je također faktor koji se ne može ignorirati: zbog neizbježnog prisustva nekih finih čestica, posebno uzoraka nukleinskih kiselina, u uzorku. Prisustvo tih malih čestica ometa rezultate testa. Da bi se minimizirao efekat čestica na rezultate ispitivanja, apsorpcija nukleinske kiseline mora biti najmanje veća od 0,1 A, a apsorbancija je poželjno između 0,1 i 1,5 A. U ovom rasponu, interferencija čestice su relativno male i rezultat je stabilan.
To znači da koncentracija uzorka ne smije biti preniska ili previsoka (izvan ispitnog područja fotometra). Konačno, radni faktori, kao što je miješanje, trebali bi biti dovoljni, inače je vrijednost apsorbancije preniska, čak i negativne vrijednosti; smeša ne može da ima mehuriće, prazna tečnost nema suspendovanu materiju, inače čitanje drastično pada; istu kivetu treba koristiti za testiranje uzorka i uzorka U suprotnom, razlika u koncentraciji je prevelika; faktor konverzije i jedinica koncentracije uzorka se biraju dosledno; ne može se koristiti kiveta sa habanjem prozora; zapremina uzorka mora da dostigne minimalnu zapreminu koju zahteva kiveta.
Pored koncentracije nukleinske kiseline, spektrofotometar takođe pokazuje nekoliko veoma važnih odnosa koji ukazuju na čistoću uzorka, kao što je odnos A 260 / A 280, koji se koristi za procenu čistoće uzorka, jer je apsorpcioni pik proteina 280 nm. Čisti uzorak sa odnosom većim od 1.8 (DNK) ili 2.0 (RNA). Ako je odnos manji od 1,8 ili 2,0, to ukazuje na prisustvo proteina ili fenolnih supstanci. 230 ukazuje da su neki kontaminanti prisutni u uzorku, kao što su ugljeni hidrati, peptidi, fenoli itd., A odnos čišće nukleinske kiseline A 260 / A 230 je veći od 2.0. A 320 detektuje zamućenost rastvora i druge faktore interferencije. Za čiste uzorke, A 320 je uglavnom 0.
Hangzhou Sumer Instrument Co., Ltd
Dodati: No.168 Wuchang Ave., Yuhang Distrikta, Hangzhou 310023, Kina
TEL: + 86-571-88739859
Telefon: +8618658504900
E-mail: info@sumerlab.com
Web: sumerinstrument.com