Увод у принцип и примену општих компоненти спектрофотометра

Спектрофотометар се широко користи у биолошким, хемијским, клиничким и еколошким истраживањима.
Спектрофотометрија мери колико светлости хемикалија може апсорбовати пролазећи сноп светлости кроз узорак у спектрофотометру.
Мерењем откривеног интензитета светлости, метода се може користити за одређивање концентрације раствора у узорку.
Концепт спектрофотометрије
Зрака послата узорку састоји се од фотонског снопа.
Кад се фотони сусретну с молекулима у узорку, молекули могу апсорбирати неке од њих, смањити број фотона у снопу и смањити интензитет сигнала детекције.
Продајни део је део светлости који пролази кроз узорак. Дефинише се као интензитет светлости који пролази кроз узорак при интензитету упадне светлости.
Апсорбанција је супротна пропустљивости, која одговара количини мереној спектрофотометром.
Према апсорбанцији концентрација узорка раствора може се одредити из закона Ламбертовог закона, што показује да постоји линеарни однос између апсорбанције и концентрације узорка. Према Ламбертовом закону о пиву, апсорбанција је производ коефицијента апсорпције, који је мерило количине светлости апсорбоване раствореном на одређеној таласној дужини и удаљености кроз коју пролази светлост. Узорак или путна удаљеност и концентрација раствора. Опћенито, циљ мјерења апсорбанције је мјерење концентрације узорка.
Компоненте спектрофотометра
Сваки спектрофотометар састоји се од извора светлости, колиматора (сочива или уређаја за фокусирање за пренос јаких и правих снопова), монохроматора за одвајање снопа различитих таласних дужина и селектора дужине за избор таласа или жлеба жељене таласне дужине. Таласна дужина светлости која се користи у спектрофотометру представљеном у овом видеу налази се у распону ултраљубичастог и видљивог светла. Спектрофотометар такође садржи држач узорка, фотодетектор и екран на коме се приказују резултати детектора.
Најновији спектрофотометар директно је повезан са рачунаром, где се могу контролисати експериментални параметри и приказати резултати.
Принцип рада спектрофотометра
Приликом обављања спектрофотометрије важно је предузети одговарајуће мере предострожности, као што су ношење рукавица, у зависности од врсте биолошког или хемијског раствора који користите.
Укључите уређај и пустите да се лампа и електроника греју пре мерења УВ-Вис спектра узорка.
Припремите празан узорак истог раствора са истим пХ и сличном јонском снагом, али без компоненти које се анализирају; с обзиром да кивета и растварач могу да шире светлост, потребно је анализирати узорак.
Традиционални држач за узорак спектрофотометра дизајниран је за држање пластичних и кварцних посуда. Оригинално растворење одложите у посуду.
Након што обришете све отиске прстију и прскате их по спољној страни посуде, правилно убаците кивету у држач узорка и затворите врата поклопца.
Никада не заборавите да затворите врата, јер УВ зрачење са отвореног спектрофотометра може оштетити ваше очи и кожу.
Програмирајте жељену таласну дужину или распон таласних дужина који ће се пренијети на узорак. То зависи од најбоље таласне дужине коју компонента која се анализира може да апсорбује. Потом се машина нултира мерењем празног узорка, који одузима доњу апсорбанцију захваљујући пуферу узорка.
У зависности од врсте експеримента спектрофотометрије који радите, можда ће бити потребно да се генерише стандардна крива пре мерења узорка, из које се може одредити концентрација једињења анализираног у узорку.
Пустите да узорак достигне одговарајућу температуру и лагано мешајте да не би дошло до стварања мехурића. Узорак се затим може додати директно у посуду унутар машине и може се очитати.
Након што је узорак измерен за апсорбанцију, експеримент се правилно израчунава; на пример, за одређивање нивоа концентрације или активности ензима.
Примена спектрофотометра
Једна од уобичајених примена спектрофотометра је за мерење ћелијске густине. Мерење густине ћелије може се користити за производњу логаритамске кривуље раста бактерија, из које се може одредити оптимално време за интеграцију рекомбинантног протеина.
Спектрофотометар се такође може користити за мерење брзине хемијске реакције. У овом аспекту, апсорбанција се користи за надгледање ензимске реакције, која временом нестаје кроз интермедијарну реакцију од 452 нм. Брзина овог ензиматског корака може се израчунати упоређивањем података с одговарајућом једначином.
Увођењем микро спектрофотометра елиминише се потреба за држачем узорка. Ови спектрофотометри користе површинску напетост за одржавање узорка.
Микроспектрофотометар је најбољи избор за мерење масе и концентрације малих и скупих узорака, попут биомолекула, укључујући протеине и нуклеинске киселине.
Апсорбанција протеина на 280 нм зависи од садржаја ароматичних бочних ланаца који се налазе у триптофану, тирозину и фенилаланину, као и дисулфидне везе између два цистеина.
Концентрација протеина може се одредити његовом апсорпцијом на 280 нм и коефицијентом апсорпције који је заснован на саставу аминокиселина.
ДНК и РНА имају максималну апсорбанцију на 260 нм, из које се могу одредити њихове концентрације. Чистоћа нуклеинских киселина такође се може проценити из односа очитавања апсорбанције према специфичним таласним дужинама.